ביוטכנולוגיה/ריבוי גנים בשיטת P.C.R

PCR

PCR – שיטה להגברת מקטע דנ"א במהירות.

חומרים :

1. Taq פולימראז – הפרדת הגדילים במבחנה מתבצעת על ידי הגברת טמפרטורה, ולכן האנזים המשכפל את מקטע הדנ"א חייב להיות עמיד לחום. אנזים המבצע פעולה דומה לפעולתו של דנ"א פולימראז, נמצא אצל חיידק תרמופילי (חיי במקומות חמים; מעינות חמים).
2. אוליגו נוקליאוטידים – נוקליאוטידים סינתטיים מטיפוס dNTP, אבני הבניין של הדנ"א העתיד להיווצר במהלך השכפול.
3. זוג תחלים – פרימרים המתאימים לקצוות הגדילים (כמובן מאותו סוג : רנ"א, דנ"א וכדומה).
4. תבנית דנ"א - מכונה גם "דנ"א מקור". זהו דנ"א ממקור מסוים הכולל את המקטע המיועד להגברה המכונה גם "המקטע הרצוי".
5. בופר – כשישנו שימוש באנזימים בתהליך מסוים, יש חובה לשמור על רמת PH קבועה בה האנזימים יהיו פעילים, על כן יש צורך בבופר שישמור על רמת PH יציבה לאורך תהליך ההגברה.

שלבי השיטה :

1. דנטורציה ; בטמפרטורה 94 מעלות צלזיוס – מובילה לדנטורציה בין גדילי הדנ"א, כך שמתקבלים שני רצפי דנ"א חד גדילים.
2. Annealin : בטמפרטורה 55 מעלות צלזיוס – הצמדות הפרימרים לגדילי הדנ"א הפרודים .
3. פולימריזציה ; בטמפרטורה 72 מעלות צלזיוס – Taq פולימראז מסנתז דנ"א משלים על כל אחד מהגדילים, בהמשך לפרימר.

המכשיר חוזר על שלבים אלו מספר פעמים ולאחר מכן הראקציה בטמפרטורה המתאימה (72 מעלות צלזיוס).

כמות הדנ"א המתקבל

כמות הדנ"א שנקבל : a*2n.

a – כמות הדנ"א שהונחו במבחנה.

n – מספר המחזורים.

עקרונות השיטה (חשוב בדרך כלל שואלים):

• זול.
• מהיר.
• אין צורך לנקות את הדנ"א.

יתרונות וחסרונות של השיטה

יתרונות	חסרונות
פשוט ומהיר	קבלת מוטציות – בשכפול דנ"א בתאים מידת הדיוק גבוהה ביותר, משום מקיימות בהם מערכות אנזימים האחראיות לתיקון טעויות. לעומת זאת, לא לכל האנזימים המשמשים לתהליך שכפול ב-PCR ישנה יכולת תיקון טעויות.
רגישות – המכשיר יכול להתחיל את התהליך מכמות זעירה של דנ"א ואפילו מדנ"א שמקורו בתא אחד.	נדרש מידע מוקדם על רצף המקטע המשוכפל -רצף הדנ"א המיועד להגברה צריך להיות ידוע לפחות בחלקו כדי לאפשר יצירת תחלים.
עוצמתיות - אין צורך בתהליך של ניקוי ובידוד הדנ"א המבוקש.	סטריליות - PCR מאפשר הגברה של מקטע דנ"א ספציפי גם אם הוא בדרגת ניקיון נמוכה או באיכות ירודה.
	מגבלת גודל – מקטעים שגודלם עולה על מספר אלפי בסיסים בודדים אינם עוברים שכפול יעיל.
	ספצפיות הפרימריים - למניעת יווצרות תוצרים לא רצויים.

תחומי ישום :

1. שיבוט – החדרת מקטע דנ"א שמקורו ב-PCR לאורגניזם.
2. זיהוי פלילי ; מעקב אחר STR - (Short Tandem Repeats) STR הם מקטעים הקיימים בגנים של בני אדם. בכל אדם קיים מספר חזרות שונה של STR. בזיהוי פלילי, משווים בין חזרות של אתרי ה-STR (בדרך כלל, בודקים עבור 8 אתרים) המצוי בזירת הפשע לבין אלו של החשוד. למרות כל זאת, יש לזכור כי ישנה סבירות קטנה, כי ישנם שני בני אדם בעלי אותם מספרי חזרות דבר היוצר בעיה משפטית (כמו הסיפור של אורנת'ל ג'יימס סימפסון). כמו גם, ב-STR נעזרים לקביעת קרבה משפחתית.
3. יצירת מוטציות נקודתיות מבוקשות.
4. סריקת ספריות זיהוי זיהום חיידקי או נגיפי - חסר. באופן עקרוני, לא חיביים לדעת את כל הדוגמאות.
5. אבחון טרום לידתי - אבחון למציאת מחלה תורשתית ידועה בשלב העוברי. האבחון נעשה בשלב מוקדם של הפריה חוץ גופנית (יום שלישי להפריה), כאשר העובר בן 8 תאים. בשלב זה התאים אינם ממוינים וההוצאה של תא יחיד אינה פוגמת בהתפתחות העובר. נעזרים ב-PCR על מנת להגביר את מקטע הדנ"א שנלקח.
   

גילוי המוטציה / רצף פגום – קיימים אבחונים שונים למצבים שוים. 2 אבחונים מקובלים :

• המוטציה גורמת להעלמות/הופעת אתר הגבלה – הקביעה תתבסס על פי חיתוך אתר רסטרקציה, כלומר אם המחלה מאופיינת בהופעת אתר הכרה, הסימן לכך שיש מחלה יהיה חיתוך הדנ"א, ולהפך. הקביעה לגבי האם יש מחלה או אין, תלויה בסוג הפרימרים שבוחרים. אם הפרימרים מתאימים לרצף המחלה ויש ריבוי מקטעי דנ"א, סימן כי העובר חולה, ולהפך.
• המוטציה אינה מוטציה נקודתית – יצירת גלאי עבור האזורים הפגומים. הקביעה תתבסס על כך שייווצר PCR רק אם יש מחלה.

RT PCR

אותו עקרון כמו PCR רגיל, אולם, תוצר ההגברה של RT – PCR הוא מקטע cDNA. שיטה זו מתאימה למחקר, אפיון וזיהוי התבטאות גנים ועוד.