ביוטכנולוגיה/מעבדות/קביעת ריכוז חלבון

הקדמה

חומצות אמינו ארומטיות – חומצות שכאלה בעלות תכונה ייחודית. היא תכונה של קבוצת תרכובות אורגניות (הקרויות תרכובות ארומטיות), בהן קיימים קשרים קוולנטיים שאינם בדיוק קשרים בודדים, ואינם קשרים כפולים, אלא מהווים מין מצב ביניים בין שני סוגי הקשרים. במילים אחרות : יש תנועה והחלפה של הקשרים באופן קבועה :

תכונה זו מצוירת :

הבעיה עם קביעת ריכוז חלבון : חלבון הוא נוזלי ושקוף.

הפתרונות לקביעת ריכוז חלבון :

בכל השיטות הבאות חייבים לעשות עקום כיול עבור ערך בליעת החלבון מול ריכוז החלבון. השיטה הנפוצה ביותר היא BSA (Bnive Serum Albumin – החלבון אלבומין מסרום של בקר ).

קביעת חלבון בעזרת UV באורך גל 280nm

בשל נוכחות של חומצות אמינו ארומטיות הנמצאות בחלק מהחלבונים ניתן לעקוב אחר חומצות אמינו ארומטיות (ככל שיש יותר חומצות ארומטיות ריכוז האנזים גדל). ההנחה היא שריכוז ח. אמינו משקף את ריכוז החלבון.

שיטת ביורט

מבוססת על חלבונים בעלי לפחות שני קשרים פפטידיים. השיטה מאפשרת בדיקה עבור ריכוזי חלבון 1-10 מ"ג/מ"ל. השיטה מתבססת על כך שיוני נחושת (Cu⁺²) בסביבה בסיסית יוצרים 4 קשרים פפטידים. בעקבות הקשר הפפטידי שנוצר צבע התמיסה (מכחול לורוד) משתנה. מכאן : ככל שיש ריכוז חלבון גבוה יותר כך צבע התמיסה יהיה חזק יותר.

שיטת ברדפורד

מבוססת על חלבון המגיב עם חלבון ששמו קומסי בלו (Comassie Brilliant Blue). כאשר קומסי בלו מגיב עם חלבון, הקבוצות הסולפניות (SO^-3) מגיבות עם שיירים טעונים חיובית בחלבון (חומצות אמינו חיוביות : ליזין, היסטדין וארגנין), והצבע משתנה מחום לכחול עז.

השוואה בין השיטות השונות

	קביעת חלבון בעזרת UV באורך גל 280mn	שיטת ביורט	שיטת ברדפורד BSA
מתבססת	חלבונים בעלי קבוצות ארומטיות.	מתבסס על לפחות 2 קשרים פפטידים	מתבססת על שיירים חיובים המגיבים עם קומסו בלו
טווח ריכוזים	0.1 mg/ml	1-10 מ"ג/מ"ל	2 טווחים (תלוי מה בוחרים) : 0.1-1 מ"ג למ"ל. 1-10 מיקרוגרם למ"ל.
רגישות	נמוכה	פחות רגישה מברדפורד, אך יותר מקביעת חלבון בעזרת UV.	רגישה מאוד ולכן היא הכי נפוצה.
שיפוע – ככל שהשיטה יותר רגישה כך השיפוע גבוהה יותר	נמוך, עקב רגשות נמוכה, השיפוע שמתקבל הוא נמוך.	בנוני.	גבוהה
הרכב החלבון - שונות בין חלבונים	קיים - כאשר יש לנו חלבון בעל 2 קבוצות ארומטיות המכשיר יתייחס אליו כאילו הוא 2 חלבונים, ולכן ערך הבליעה יציין כי יש "הרבה" חלבונים למרות שיש מעט.	אין שונות בין החלבונים.	קיים שונות בין חלבונים.
גורמים נוספים המשפיעים על הרגישות	תא	הרגישות נמוכה כיוון שהשיטה רגישה לחומרים מפריעים (כגון Ph, טריס ועוד)	רגישה לחומרים בתמיסה – מושפעת מ-SDS, מטענים ועוד
פגיעה בחלבון	אין (יתרון)	יש	יש
שלב הכנות	אין (יתרון)	יש	יש
		קלה לביצוע
צבע	-	כחול לורוד	מחום לכחול

תחום קריאה בספקטופוטומטר

כאשר המכשיר אינו יכול לקרוא את ערכי הבליעה. קיימים 2 אפשרויות:

1. בריכוזים נמוכים של חלבון - הצבע המתקבל הוא חלש מאוד ולכן קשה מאוד למדוד את הערכים השונים ולקבוע את ההבדלים שבניהם (הספקטרופוטומטר אינו רגיש לטווח נמוך כל כך של ערך בליעה).
2. בריכוזים גבוהים של חלבון – אפשר למהול את התמיסה (עקב המיהול נצטרך להשתמש ב-CV.

מהלכי ניסוי

• קביעת ריכוז חלבון על פי בליעה באורך גל 280nm
• קביעת ריכוז חלבון בשיטת ביורט
• קביעת ריכוז חלבון בשיטת ברדפורד
  • קביעת חלבון בטווח ריכוזים שבין 0.1 ל1- מ"ג\מ"ל
  • קביעת חלבון בטווח ריכוזים שבין 1 ל10- מיקרוגרם\מ"ל

שאלות שמופיעות בבגרות

חסר