ביוטכנולוגיה/מעבדות/ניקוי ליזוזים בעמודת זיקה

הקדמה

עמודת הזיקה היא קולונה המכילה CMC, צמר זכוכית וממס, דרכה מעבירים תמיסת חלבונים במטרה להותיר את החלבון המבוקש בקולונה אחרון מבין החלבונים בתמיסה הנבדקת.

עמודה זו פועלת בדומה למחליף היונים, בו מטעינים פולימר סוכרי(שרף), בעמודת זיקה משתמשים בצמר זכוכית, בממס ובשרף בשם CMC. נוזל זה טעון במטען חשמלי שלילי, אליו החלבון ייקשר או יידחה.

מטרת הניסוי

הפקת האנזים לזוזים מתערובת חלבונים - חלבון ביצה.

מהלך הניסוי

להכנת הקולונה יש צורך להכניס לפי הסדר:

1. צמר זכוכית (ניתן להשתמש גם בחול ובסיבי סיליקון)
2. ממס
3. CMC
4. בופר

השלב הראשון

בשלב זה, יש צורך בבופר (למשל בופר טריס pH=8.2) שישמור על PH קבוע, ה-PH של הבופר חייב להיות קטן מערך הPH של הנקודה האיזואלקטרית של החלבון הנבדק. כל עוד הPH נמוך מה-PI של הליזוזים (PI=9.4), המטען של החלבון יהיה חיובי והוא ייקשר לCMC שבקולונה, שכן המטען שלו הוא שלילי.

לאחר הכנסת הבופר, מטעינים את הקולונה בחלבונים ומתחילים בהרצתם בפרקציות כשהחלבון הרצוי לנו קשור עדיין לקולונה, תוך כדי הרצת החלבונים מוסיפים בופר כדי שה-CMC לא יתייבש.

את הפראקציות בודקים במכשיר הספקטרופוטומטר, באורך גל 280 ננו-מטר, אורך גל זה הוא בלתי נראה כיוון שלתמיסת החלבונים אין צבע משתמשים בטבעת הארומתית שלהם (בולעת אור באורך גל זה)כמדד לספקטרום הבליעה.

השלב השני

בשלב השני, מכניסים בופר (למשל בופר קרבונט pH=10.5) שישמור על PH גבוהה מה-PI של החלבון הנבדק, כלומר, אנחנו מנתקים את החלבון מה-CMC (כיוון שכעת החלבון בעל מטען שלילי ) ומתחילים להריץ את הפרקציות. את הפרקציות הללו בודקים במכשיר הספקטרופוטומטר באורך גל 280 ננו-מטר בהתאם לתהליך בשלב הראשון.

השלב השלישי

בשלב השלישי, מעבירים דגימה מכל פרקציה לקווטה כדי לבדוק את נוכחותו של האנזים בפרקציות השונות בעזרת פעילותו האנזימטית. לשם כך בודקים את הפירוק האנזימטי של דפנות חיידקים בידי ליזוזים . לכל הדגימות יש להוסיף בופר פוספט לכל קווטה כדי לשמור על יציבות הליזוזים. את ערך הבליעה בקיווטות יש למדוד באורך גל נראה -540 ננו-מטר, במשך דקה (במרווחים של 10 שניות), כיוון שדפנות התאים מקנות עכירות לתמיסה אורך גל נראה ייתן אינדיקציה לפירוק.

בקרות ואיפוסים

1. קווטה עם בופר טריס בלבד - לקריאת הבליעה של הפרקציות מהשלב הראשון.
2. קווטה עם בופר קרבונט בלבד - לקריאת הבליעה של הפרקציות מהשלב השני.
3. קווטה עם בופר פוספט בלבד - לקריאת הבליעה של הקווטות מהשלב השלישי.