לדלג לתוכן

ביוטכנולוגיה/מעבדות/השפעת ה-pH על פעילות האנזים אינברטז

מתוך ויקיספר, אוסף הספרים והמדריכים החופשי

הקדמה

[עריכה]

בניסוי זה ובניסוי השפעת הטמפרטורה על פעילות האנזים טריפסין אנו נבצע את הנלמד מפרק הלימוד ביוכימיה - השפעת PH על מבנה חלבון. הבנת החומר התאורתי תקל על פתרון השאלות.

פעילות לעצירת פעילות אנזים :

[עריכה]
  • חום – דנטורציה.
  • סמנר - חומצה חלשה.

ראה : ביוכימיה – מטעני חלבון.

הניסוי

[עריכה]
  • אנזים: אינברטאז - אנזים המפרק סוכרוז (סוכר לא מחזר) לגלוקוז ולפרוקטוז (סוכרים מחזרים). מצוי בכמויות גבוהות בשמרי אפייה.
  • סובסטרט : סוכרוז.
  • קשר גליקוזיצי – קשר בין סוכרים הנוצר ע"י פליטת מולקולת מים. הקשר נוצר בין פחמן קרבוקסילי אחד לפחמן של הסוכר אחר.

נוסחאות

[עריכה]

הנוסחאות שיש לדעת :

  1. פעילות ספציפית (Specific Activity)
  2. העשרה
  3. ניצולת

ראה :

  • מושגים - שיטות ניקוי- מעקב אחר ניקוי חלבון בטבלת העשרה
  • חישובים

מהלך הניסוי

[עריכה]

מציאת pH אופטימלי עבור אנזים

[עריכה]
  • שורה של מבחנות בעלות pH שונה עם סובסטרט.
  • הוספת האנזים (במקרה שלנו הוספת אינברטאז).
  • הוספת מגיב לתוצר הפירוק(סמנר או סמירנוף למשל) או לסובסטרט.
  • מרתיחים.
  • קריאה (במקרה שלנו באורך גל 540mn) ובדיקת פעילות (ע"פ הגרף שנוצר).

בקרות ואיפוסים

[עריכה]
  1. מבחנה ללא אנזים וסוכרוז (סמנר בלבד) – לאיפוס ספקטופוטומטר ; נטו ערך בליעה.
  2. מבחנה עם סובסטרט – לבדיקת פירוק הספונטאני של הסובסטרט.
  3. מבחנה עם אנזים – לבדיקת פעילות האנזים.

הקשר בין יציבות האנזים ל-pH וטמפרטורה אופטימלי

[עריכה]

אין קשר בין pH וטמפרטורה אופטימאלית לבין יציבות האנזים. יתכן כי האנזים פועל בטמפרטורה או pH מסוים אך אינו יציב.

מהלך הניסוי

[עריכה]
  1. לקיחת שורת מבחנות בעלות pH שונים עולים.
  2. הוספה אנזים (אינברטאז) וסובסטרט (סוכרוז) לכל המבחנות.
  3. הפסקת פעולה אחרי 5 דקות, בהוספת הסמנר (חומצה).
  4. הנחה במים רותחים.
  5. קריאת אחוז בליעה (לסמנר" 540nm).

בקרות :

  • מבחנה עם סוכרוז - למציאת התפרקות ספונטי של הסובסטרט.
  • מבחנה עם אנזים.
  • מבחנה ללא סוכרוז ואנזים לאיפוס.

חומר נוסף

[עריכה]

שיטות הפרדת חלבון (דיאגנוסטי פופרטיבי = אבחון לניקוי חלבון)

[עריכה]

תבנית:לאחד לתוך

  • דיאליזה
  • כמוטוגרפיה בג'ל.
  • ג'ל פילטרציה/מסננת מולקולרית.
  • השקעה איזואלקטרית (ב-PI)
  • מחליף יונים.
  • אלקטרופורזה בנייר.
  • כמוטוגרפית זיקה.
להסברים ראה : שיטות הפרדה
  • דנטורציה בחום – ביצוע דנטורציה לחלבונים. כתוצאה מכך כל החלבונים ההידרופוביים יתחברו ויצרו משקע. כמובן, שלא נבצע דנטורציה עבור החלבון המבוקש.
  • השקעה במלח
  • TLC - הרצה על נייר הידרופילי בנוזל הידרופובי. חלבונים הידרופילים ירוצו פחות רחוק.
  • סילקציה - קולונה בעלת שרפים הידרופילים/הידרופוביים.מבוסס על מחלף יונים.

pH אופטימלי (PI) – לכל חלבון, קיים PH אחד בו מטעניו (של החלבון) שווים לאפס. ב-PI זה, החלבונים יעברו אגרגציה.

גרף של Ph אינו סימטרי, בגרף תהיה נקודת מקסימלית אחת (בהנחה שבתערובת קיים חלבון יחיד)

קישורים חיצוניים

[עריכה]

מעבדה 8.3 מתוך "לקט ניסויים בביוכימיה מכשירית"