ביוטכנולוגיה/שיטות לאפיון גנים

מתוך ויקיספר, אוסף ספרי הלימוד והמדריכים החופשי.

עד כה : בנינו ספריה, איתרנו את הגן המבוקש ועתה אנו רוצים לאפיין את הגן. בתוכנית הלימודים מצויין כי יש לדעת 2 שיטות בלבד (הספג צפוני ודרומי), עם זאת, שאר הדוגמאות נשאלות בבחינת הבגרות ולכן הם סופחו לנושא זה.

תוכן עניינים 1 הספג דרומי (Southern blot) 2 הספג צפוני (northern bolt) 2.1 חידוד ההבדלים 2.2 השוואה בין הספג דרומי לבין הספג צפוני 3 איפיון קטעי ד.נ.א. ארוכים 4 הספג מערבי (Western Bolt) 5 שימוש בגן מדווח (Reporter Gene)

[עריכה] הספג דרומי (Southern blot)

שיטה לבדיקת נוכחות גן ביצור.

חשיבות התהליך : חסר

תחומי שימוש :

1. איתור מקטע דנ"א מבוקש.

תיאור התהליך :

1. חיתוך הדנ"א הנתון ממקורות שונים באנזימי רסרקציה.
2. הרצה בג'ל אגרוז.
3. הספגה – העברת הדנ"א מהג'ל לממברנה (פילטר).
4. טיפול כימי ליצירת דנ"א חד גדילי והוספת גלאי מסומן.
5. היברידיזציה – שימוש בגלאי לאיתור המושבה. הגלאי יכול להיות מסומן בר"א (ביצוע אוטורגיוגרפיה) או מסומן פלורוסנטי (שימוש במיקרוסקופ פלורוסנטי.

ניתוח תוצאות : השיטה בודקת האם קיים הגן ביצור חי – כן / לא. כלומר, בבדיקה בה הופיע פס מסומן; זו בדיקה בה קיים הגן. שימו לב, כי בדיקה עבור אותו יצור חיי (עבור איברים שונים) צריכה לתת את אותה תשובה (כן/לא) עבור כל האיברים. זאת כיוון שהחומר התורשתי קיים בכל איברי היצור, בגרעין.

[עריכה] הספג צפוני (northern bolt)

שיטה לבדיקת ביטוי הגן. בודקת ב-2 רמות :

1. האם הגן מתבטא (כלומר, האם נוצר mRNA בתא?)?
2. באיזו כמות מתבטא החלבון.

חשיבות התהליך : חסר

תחומי שימוש : חסר

תיאור התהליך :

1. חיתוך ה-mRNA מאיברים שונים באנזימי רסרקציה.
2. הרצה בג'ל אגרוז.
3. הספגה – העברת ה-mRNA מהג'ל לממברנה (פילטר).
4. טיפול כימי ליצירת רנ"א חד גדילי והוספת גלאי מסומן (גלאי רנ"א).
5. היברידיזציה – שימוש בגלאי לאיתור המושבה. הגלאי יכול להיות מסומן בר"א (ביצוע אוטורגיוגרפיה) או מסומן פלורוסנטי (שימוש במיקרוסקופ פלורוסנטי.

ניתוח תוצאות :

1. שוב, היכן שקיים פס מסומן – זו בדיקה בעלת הגן, כלומר, זהו האיבר המייצר את החלבון.
2. אופי הפס – מסמן כמה מבוטא החלבון ; כמה מיוצר. ככל שהפס חזק יותר, כך יש נוצר יותר חלבון.

[עריכה] חידוד ההבדלים

נניח שאנו מחפשים כלורופיל. החלטנו להריץ בג'ל מקטעים שונים מאיברים שונים הקיימים בצמח, למשל : גבעול, עלה, פרח ושורש. נריץ את מקטעי הדנ"א ורנ"א בשני סוגי ההספגים. התוצאות אותם נקבל  :

1. עבור הספג דרומי – בכל הדגימות יהיה פס אחד מסומן, כיוון שהגן קיים בכל איברי הצמח, בגרעין.
2. עבור הספג צפוני - נניח כי הסימון יהיה קיים בעלה, בשורש ובגבעול. כאשר בעלה יש את הכמות הגדולה ביותר של כלורופיל (צבע שחור החזק ביותר), אחר כך בגבעול ולבסוף בשורש.

[עריכה] השוואה בין הספג דרומי לבין הספג צפוני

חסר

[עריכה] איפיון קטעי ד.נ.א. ארוכים

חסר

[עריכה] הספג מערבי (Western Bolt)

מטרה : בדיקת נוכחת של חלבון לו קיים נוגדן.

השיטה :

1. בתוך תערובת מצויי אנטיגן (חלבון) אותו אנו רוצים למצוא.
2. הרצה בתוך חלבון ג'ל את מרכיבי התערובת.
3. הספגה = העברה לממבראנת (נייר) ניטרוצלולוז.
4. הוספת חלבון אינרטי (בדרך כלל חלב) לחסימת אתרים פנויים בממבראנה.
5. הוספת נוגדן ראשוני (1stAb) הנקשר לאנטיגן המבוקש.
6. הוספת נוגדן שניוני (2stAb) מסומן אנזימטית + סובסטרט (יוצר צבע), הנקשר אל הנוגדן הראשוני. בעקבות ההיקשרות נוצר תוצר בלתי מסיס.
7. פסי הצבע של התוצר מעיד על מיקום האנטיגן (במקרה שלנו ב-A ו-D).

[עריכה] שימוש בגן מדווח (Reporter Gene)

כאשר ברצוננו לאפיין גן בקרה כמו פרומטור. בניגוד לחלבון לו יש תוצר, לגן בקרה אין תוצר חלבוני.

המטרה בעבודה עם גן מדווח היא לחקור רצפים הפועלים כרצפי בקרה. כיוון שאין להם תוצר חלבוני, הדרך לאפיין את פעולתם היא באמצעות מעקב אחר הגן המופעל על ידם. אל גן הבקרה מחברים גן מדווח, במקום הגן המופעל בידי גן הבקרה. הגן מדווח מאיר אור כאשר גן הבקרה פועל.. קימיים גנים מדווחים רבים, בניהם החלבונים הפלורסנטיים GFP (Green Fluoresces Prot) ו-RFP (Red Fluoresces Prot).

דוגמא : האם זהו רצף הבקרה של מערכת תיקון מוטציות בדנ"א?

השלבים שנבצע :

• חיבור גן מדווח.
• חשיפת החיידק לחומרים המעודדים יצירת מוטנטים.
• רצף הבקרה "מתעורר" ופועל.
• גן מדווח "נע" / "נדחף" ולכן הוא זוהר.
• כלומר, הגן בקרה, הכן כן המתקן מוטציות בדנ"א.