ביוטכנולוגיה/ריבוי גנים בשיטת P.C.R

מתוך ויקיספר, אוסף ספרי הלימוד והמדריכים החופשי.

תוכן עניינים 1 PCR 1.1 חומרים : 1.2 שלבי השיטה : 1.3 כמות הדנ"א המתקבל 1.4 עקרונות השיטה (חשוב בדרך כלל שואלים): 1.5 יתרונות וחסרונות של השיטה 1.6 תחומי ישום : 2 RT PCR

[עריכה] PCR

PCR – שיטה להגברת מקטע דנ"א במהירות.

[עריכה] חומרים :

1. Taq פולימראז – הפרדת הגדילים במבחנה מתבצעת על ידי הגברת טמפרטורה, ולכן האנזים המשכפל את מקטע הדנ"א חייב להיות עמיד לחום. אנזים המבצע פעולה דומה לפעולתו של דנ"א פולימראז, נמצא אצל חיידק תרמופילי (חיי במקומות חמים; מעינות חמים).
2. אוליגו נוקליאוטידים – נוקליאוטידים סינטטיים.
3. זוג תחלים – פרימרים המתאימים לקצוות הגדילים (כמובן מאותו סוג : רנ"א, דנ"א וכדומה).
4. תבנית דנ"א.
5. בופר – חובה עבודה עם אנזים.

[עריכה] שלבי השיטה :

1. דנטורציה ; בטמפרטורה 94 מעלות צלזיוס – מובילה לדנטורציה בין גדילי הדנ"א, כך שמתקבלים שני רצפי דנ"א חד גדילים.
2. Annealin : בטמפרטורה 55 מעלות צלזיוס – הצמדות הפרימרים לגדילי הדנ"א הפרודים .
3. פולימריזציה ; בטמפרטורה 72 מעלות צלזיוס – Taq פולימראז מסנתז דנ"א משלים על כל אחד מהגדילים, בהמשך לפרימר.

המכשיר חוזר על שלבים אלו מספר פעמים ולאחר מכן הראקציה בטמפרטורה המתאימה (72 מעלות צלזיוס).

[עריכה] כמות הדנ"א המתקבל

כמות הדנ"א שנקבל : a*2n.

a – כמות הדנ"א שהונחו במבחנה.

n – מספר המחזורים.

[עריכה] עקרונות השיטה (חשוב בדרך כלל שואלים):

• זול.
• מהיר.
• אין צורך לנקות את הדנ"א.

[עריכה] יתרונות וחסרונות של השיטה

יתרונות	חסרונות
פשוט ומהיר	קבלת מוטציות – Taq אינו מבצע הגהה כמו פולימראז ולכן עלולים לקבל מוטציות.
רגישות – המכשיר יכול להתחיל את התהליך מכמות זעירה של דנ"א.	נדרש מידע מוקדם על רצף המקטע המשוכפל.
אין צורך בתהליך של ניקוי ובידוד הדנ"א המבוקש.	סטרליות
	מגבלת גודל – מקטעים גדולים אינם עוברים שכפול יעיל.
	ספצפיות הפרימריים - למניעת יווצרות תוצרים לא רצויים.

[עריכה] תחומי ישום :

1. שיבוט – החדרת מקטע דנ"א שמקורו ב-PCR לאורגניזם.
2. זיהוי פלילי ; מעקב אחר STR - (Short Tandem Repeats) STR הם מקטעים הקיימים בגנים של בני אדם. בכל אדם קיים מספר חזרות שונה של STR. בזיהוי פלילי, משווים בין חזרות של אתרי ה-STR (בדרך כלל, בודקים עבור 8 אתרים) המצוי בזירת הפשע לבין אלו של החשוד. למרות כל זאת, יש לזכור כי ישנה סבירות קטנה, כי ישנם שני בני אדם בעלי אותם מספרי חזרות דבר היוצר בעיה משפטית (כמו הסיפור של אורנת'ל ג'יימס סימפסון). כמו גם, ב-STR נעזרים לקביעת קרבה משפחתית.
3. יצירת מוטציות נקודתיות מבוקשות.
4. סריקת ספריות זיהוי זיהום חיידקי או נגיפי - חסר. באופן עקרוני, לא חיביים לדעת את כל הדוגמאות.
5. אבחון טרום לידתי - אבחון למציאת מחלה תורשתית ידועה בשלב העוברי. האבחון נעשה בשלב מוקדם של הפריה חוץ גופנית (יום שלישי להפריה), כאשר העובר בן 8 תאים. בשלב זה התאים אינם ממוינים וההוצאה של תא יחיד אינה פוגמת בהתפתחות העובר. נעזרים ב-PCR על מנת להגביר את מקטע הדנ"א שנלקח.
   

גילוי המוטציה / רצף פגום – קיימים אבחונים שונים למצבים שוים. 2 אבחונים מקובלים :

• המוטציה גורמת להעלמות/הופעת אתר הגבלה – הקביעה תתבסס על פי חיתוך אתר רסטרקציה, כלומר אם המחלה מאופיינת בהופעת אתר הכרה, הסימן לכך שיש מחלה יהיה חיתוך הדנ"א, ולהפך. הקביעה לגבי האם יש מחלה או אין, תלויה בסוג הפרימרים שבוחרים. אם הפרימרים מתאימים לרצף המחלה ויש ריבוי מקטעי דנ"א, סימן כי העובר חולה, ולהפך.
• המוטציה אינה מוטציה נקודתית – יצירת גלאי עבור האזורים הפגומים. הקביעה תתבסס על כך שייווצר PCR רק אם יש מחלה.

[עריכה] RT PCR

אותו עקרון כמו PCR רגיל, אולם, תוצר ההגברה של RT – PCR הוא מקטע cDNA. שיטה זו מתאימה למחקר, אפיון וזיהוי התבטאות גנים ועוד.